Die am weitesten verbreite Analysentechniken zur Bestimmung von Kohlenhydraten sind die Magnetische Kernresonanz-Spektroskopie (1H-NMR), Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), sowie Gas- und Flüssigkeitschromatographie (GC/LC) mit anschließender Massenspektrometrie (MS). Während spektrometrische Methoden teuere Geräte und hoch qualifiziertes Personal voraussetzen, erfordern gaschromatographische Methoden eine zeitaufwändige Derivatisierung.
Als Alternative empfiehlt sich die Hochleistungs-Anionen-Austauschchromatographie, die günstiger als die Massenspektrometire und schneller als gaschromatographische Methoden ist.
- Methodische Herausforderungen
In stark alkalischen mobilen Phasen werden die anionischen Bestandteile des Zuckers auf einem positiv geladenen Anionen-austauscher getrennt.
Geringfügige Unterschiede in den pKa Werten der Kohlenhydrat-Hydroxyl-Gruppen ermöglichen die Auftrennung von niedermolekularen Sacchariden.
Die Schwierigkeit besteht darin, eine Methode zu finden, welche eine einfache und ausreichend empfindliche Detektion der getrennten Kohlenhydrate erlaubt. UV- und Fluoreszenz-Detektion scheiden aus, weil weder Chromophoren noch Fluorophoren vorliegen. Der Refraktionsindex-Detektor wiederum ist mit dem Nachteil behaftet, dass er nicht empfindlich genug ist und Gradientenelution nicht möglich ist.
- Amperometrische Detektion als vielseitig einsetzbare Methode
Da Kohlenhydrate elektrochemisch aktiv sind, lassen sich die oben genannten Schwierigkeiten mittels amperometrischer Detektion überwinden.
Hierzu wird ein Verfahren angewendet, das als gepulste amperometrische Detektion (PAD) bekannt ist.
Zunächst wird eine positive Spannung (E1) angelegt, um die Target-Analyten zu bestimmen gefolgt von einem zweiten, stärker positiven Impuls (E2), durch welchen die Reaktionsprodukte mittels Oxidation von der Elektrode entfernt werden. Eine dritter, negativer Spannungsimpuls (E3) schließlich dient dazu, Oxide auf der Elektrodenoberfläche zu reduzieren.
Der gesamte, dreistufige Prozess dauert in der Regel eine Sekunde und wiederholt sich im Sekundentakt, um eine Beschädigung der Elektrode zu verhindern.
Neben Kohlenhydraten eignet sich PAD auch zur Bestimmung von Aminozuckern, Aminosäuren, biogenen Aminen, schwefelhaltigen Spezies, Alkoholen und diversen Antibiotika. |
